@article{oai:kindai.repo.nii.ac.jp:00005786,
 author = {永井,  宏平 and 齊藤,  壱騎 and 有戸,  光美 and 黒川,  真奈絵 and 加藤,  智啓},
 journal = {近畿大学生物理工学部紀要, Memoirs of the Faculty of Biology-Oriented Science and Technology of Kinki University},
 month = {Mar},
 note = {[要旨]全身性エリテマトーデス(SLE)や混合性結合組織病(MCTD)などの自己免疫疾患患者の末梢血リンパ球では, 自己抗原U1-small nuclear ribonucleoprotein 68k (U1-68k) のリン酸化が外れた低リン酸化亜型が増加していることが近年発見された. この低リン酸化U1-68kは自己免疫疾患の新たな早期診断マーカーとなる可能性がある. しかしながら, 従来法である細胞の核分画を用いた二次元western blot法は全行程に5日かかることから, より簡便な定量法の開発が必要である. そこで, 本研究ではphos-tag SDS-PAGE後にwestern blotを行う方法(phos-tag western blot法)と, 等電点電気泳動を行った後に直接western blotを行う方法(等電点western blot法)を検討した. その結果, phos-tag western blot法はU1-68kのリン酸化亜型を十分に分離することができず低リン酸化U1-68kの定量には不適であることが示された. それに対し, 等電点western blot法では, pI6.8-9.1の間に10本のU1-68kのバンドが確認され、また, そのうちの1本が目的とする低リン酸化体の等電点に一致した. ここから本方法が従来法に代わる方法として使用できる可能性が示された. 我々は更に, 細胞核画分の代わりに細胞の全抽出液を用いることが可能かを評価した. 5種類の細胞抽出液による全細胞抽出液を比較したところ, SDS-PAGEに通常用いられるSDS処理液が最も効率的にU1-68kを抽出することができ, また二次元western blot法によってU1-68kが複数のスポットとして検出できることを確認した. しかしながら, スポットが観察される領域は大きく酸性側にシフトしており, タンパク質に強く結合したSDSを除去する必要があることが示唆された.           [Abstract] Systemic autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE) or mixed connective tissue diseases (MCTD) are immunologically characterized by generation of various species of autoantibodies in sera from patients. Recently, using 2DE-western blot, we have found that a dephosphorylated form of U1-68k, a major autoanigen to the anti-RNP autoantibody, was increased in peripheral blood lymphocytes from SLE or MCTD patients. This dephosphorylated U1-68k might be used as a new diagnostic marker which could diagnosis the diseases in earlier phase. In this paper, to establish a new convenient method for quantification of the dephosphorylated form, U1-68k isoforms in nuclear fraction of Jurkat cells were separated and detected by two methods, a western blot followed by a phos-tag SDS-PAGE (phos-tag-western blot), and a western blot followed by an isoelectric focusing electrophoresis (IEF-western blot). As a result, phos-tag-western blot showed only two bands of U1-68k isoforms, indicating that this method is inadequate for our purpose. On the other hand, IEF-western blot showed at least 10 bands of U1-68k within pI range of 6.8-9.1, and one of the bands showed the same pI value (7.9) as those of the disease-specific dephosphorylated U1-68k detected by 2DE-western blot. This indicated that the IEF-western blot could be used as a new convenient method for quantification of the dephosphorylated form. In addition, we examined whether U1-68k isoforms in a whole cell extract could be detected by 2DE-westen blot. We tested 5 popular cell lysis solutions, and found that the SDS sample buffer, which is commonly used for SDS-PAGE, extract U1-68k with the highest yield, and showed multiple U1-68k spots by the 2DE-western blot. However, these spots were detected in the acidic pI regions (pI 3-5), indicating that SDS molecules may bound strongly to the U1-68ks and shift their isoelectric points. Therefore, it must be needed to eliminate the strongly combined SDS-molecules before 2DE or IEF-western blot., application/pdf},
 pages = {7--16},
 title = {<Original Papers>全身性自己免疫疾患（膠原病）の新規診断マーカーの開発を目的とした自己抗原U1-68K の疾患特異的低リン酸化体の簡便な定量法の検討},
 volume = {35},
 year = {2015},
 yomi = {ナガイ, コウヘイ and サイトウ, カズキ and アリト, ミツミ and クロカワ, マナエ and カトウ, トモヒロ}
}